Historia del DNA

HISTORIA Y AISLAMIENTO DEL DNA El ADN fue aislado por Friedrich Miescher en 1869 de esperma de salmón y de pus de heridas abiertas. Dado que la encontró solamente en los núcleos, Miescher denominó a este compuesto nucleína.("Se levantaba en pleno invierno a las 4 y se iba a orillas del Rhin con su ayudante para pescar. Luego, procedía a la extracción de nucleína en un laboratorio abierto a todos los vientos, donde la temperatura rondaba los 2 °C. Una temperatura demasiado elevada habría impedido manipular la nucleína..." ***) A posteriori se lo cambió a ácido nucleico y por último a ácido desoxirribonucleico (ADN). Robert Feulgen, en 1914, describió un método para revelar por tinción el ADN, basado en el colorante fucsina. Se encontró, utilizando este método, la presencia de ADN en el núcleo de todas las células eucariotas, específicamente en los cromosomas.Durante los años 20, el bioquímico P.A. Levene analizó los componentes del ADN. Encontró que contenía cuatro bases nitrogenadas: citosina, timina, adenina, y guanina; el azúcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. El concluyó: que la unidad básica (nucleótido) estaba compuesta de una base pegada a un azúcar y que el fosfato también estaba pegado al azúcar y lamentablemente también concluyó erróneamente que las bases estaban en cantidades iguales y, que un tetranucleótido era la unidad repetitiva de la molécula. Sin embargo queda su idea de la estructura del nucleótido el cual es realmente la unidad fundamental (monómero) del ácido nucleico (polímero).Existen cuatro nucleótidos que integran el ADN: uno con citosina (C), uno con guanina (G), uno con adenina (A), y uno con timina (T), Imagen modificada de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Aqui se muestran 3 de ellos en su forma "activa", como trifosfatos, antes de entrar en la molécula de ADN, recuerde que el nucleótido allí tiene un solo fosfato. El factor de transformación A comienzo "del año 1900", el estudio de la genética comienza a dar frutos: la relación entre el trabajo de Mendel y el de los biólogos celulares resultó en la teoría cromosómica de la herencia; Garrod propuso la relación entre los "errores innatos del metabolismo" y los genes. La pregunta quedó planteada: ¿que es un gen? La repuesta la trajo el estudio de una enfermedad infecciosa mortal la neumonía. Durante los años 20 (192... por supuesto) Frederick Griffith estudió las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus peumoniae que producía la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cápsula (también se la conoce como cepa S, del ingles smooth, o sea lisa, que es el aspecto de la colonia en las placas de Petri). La otra cepa (la R, de rugosa, que es el aspecto de la colonia en la placa de Petri) no tiene cápsula y tampoco causa neumonía. Frederick Griffith (1928) fue capaz de inducir la transformación de una cepa no patogénica Streptococcus pneumoniae EN PATOGÉNICA. Griffith postuló la existencia de un factor de transformación como responsable de este fenómeno. Griffith inyectó las diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo hacía. Luego comprobó que la cepa S, muerta por calentamiento, no causaba neumonía cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando combinaba la cepa S muerta por calentamiento, con la cepa R viva, e inyectaba la mezcla a los ratones ( recuerde que ningún componente individual de la mezcla mata a los ratones) los ratones contraían la neumonía y morían.Las bacterias que se aislaban de los ratones muertos poseían cápsula y, cuando se las inyectaba, mataban otros ratones! Hipótesis La cepa S, muerta por el calor, fue reanimada o resucitó. La cepa R viva fue modificada por algún "factor de transformación" (transforming factor). Otros experimentos mostraron que la segunda postulación era la correcta. En los años 40 (19..), Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty revisaron el experimento de Griffith y concluyeron que el factor de transformación era el ADN. Oswald Avery repitiendo el trabajo de Griffith con el agregado de una enzima que destruía el ADN, demostró que el factor de transformación era el ADN. Cuando Avery agregaba esta enzima, no observaba la transformación obtenida por Griffith. El concluyó que el material hereditario era ADN y no una proteína. Su evidencia era fuerte pero no totalmente concluyente, para esa época el "candidato principal" para ser el material hereditario eran una proteína. El uso de bacteriófagos La última palabra en la cuestión de determinar cual era el material hereditario vino de los trabajos de Max Delbruck y Salvador Luria en los 40. Los bacteriófagos son un tipo de virus que atacan a las bacterias, Delbruck y Luria trabajaron con virus que atacan a la bacteria del intestino humano Escherichia coli. Los bacteriófagos consisten en ADN con una cubierta de proteínas. Los bacteriófagos infectan una célula inyectándole su ADN. Este ADN viral "desaparece" mientras toma control de la maquinaria de la bacteria que comienza a fabricar nuevos virus. Luego de 25 minutos de haber sido inyectado la célula hospedadora estalla, liberando cientos de nuevos bacteriófagos. Como los fagos tienen solo ADN y Proteínas, eran la herramienta ideal para resolver la naturaleza del material hereditario. Modificada En 1952 Alfred D. Hershey y Martha Chase realizaron una serie de experimentos destinados a dilucidar si el ADN o las proteínas eran el material hereditario. Marcando el ADN y las proteínas con isótopos radioactivos el experimento demostraría cual de ellos entraba en la bacteria. Ese sería el material hereditario ( factor transformador de Griffith). Dado que el ADN contiene fósforo (P) pero no azufre (S), ellos marcaron el ADN con Fósforo-32 radioactivo. Por otra parte, las proteínas no contienen P pero si S, y por lo tanto se marcaron con Azufre-35. Hershey y Chase encontraron que el S-35 queda fuera de la célula mientras que el P-32 se lo encontraba en el interior, indicando que el ADN era el soporte físico de la herencia. Imagen modificada de NCBI Detalles del experimento: Las figuras de arriba son Modificadas de: University of Arizona's Bio 181 Page. Erwin Chargaff analizó las base nitrogenadas del ADN en diferentes formas de vida, concluyendo que, la cantidad de purinas no siempre se encontraban en proporciones iguales a las de las pirimidinas (contrariamente a lo propuesto por Levene), la proporción era igual en todas las células de los individuos de una especie dada, pero variaba de una especie a otra. Los experimentos de Hershey-Chase probaron que el ADN era el material genético pero, no como el ADN conformaba los genes. El ADN debía transferir información de la célula de origen a la célula hija. Debía también contener información para replicarse a si mismo, ser químicamente estable y tener pocos cambios. Sin embargo debía ser capaz de cambios mutacionales. Sin mutaciones no existiría el proceso evolutivo. Muchos científicos se interesaron en descifrar la estructura del ADN, entre ellos, Francis Crick, James Watson, Rosalind Franklin, y Maurice Wilkins. Maurice Wilkins (1999) Rosalind Franklin (1920-1958) Watson en la Conferencia de Asilomar, Estados Unidos (1979) A finales de la primavera de 1952, la cristalógrafa británica Rosalind Franklin (1920-1958) obtuvo una fotografía de difracción de rayos X que reveló, de manera inconfundible, la estructura helicoidal de la molécula del ADN. Rosalind Franklin falleció en 1958, a los 37 años, víctima de un cáncer en los ovarios. Su invaluable aportación a este descubrimiento no fue reconocida ni en vida de la cristalógrafa ni de manera póstuma, aunque poco a poco se empieza a conocer su historia. Fotografía 51. Difracción de rayos X del ADN El modelo de Watson y Cric A fines de Febrero de 1953, Rosalind Franklin, escribió en su cuaderno de notas que la estructura del ADN tenía dos cadenas, ya antes había deducido que que los grupos fosfatos se encontraban en el exterior y que el ADN existe en dos formas........ Watson y Crick eran investigadores teóricos que integraron todos los datos disponibles en su intento de desarrollar un modelo de la estructura del ADN. Los datos que se conocían por ese tiempo eran : que el ADN era una molécula grande también muy larga y delgada. los datos de las bases proporcionados por Chargaff (A=T y C=G; purinas/pirimidinas=k para una misma especie). los datos de la difracción de los rayos-x de Franklin y Wilkins (King's College de Londres). Los trabajos de Linus Pauling sobre proteínas (forma de hélice mantenida por puentes hidrógeno), quién sugirió para el ADN una estructura semejante. El ADN es una doble hélice, con las bases dirigidas hacia el centro, perpendiculares al eje de la molécula (como los peldaños de una escalera caracol) y las unidades azúcar-fosfato a lo largo de los lados de la hélice (como las barandas de una escalera caracol). http://www.ncbi.nlm.nih.gov Las hebras que la conforman son complementarias (deducción realizada por Watson y Crick a partir de los datos de Chargaff, A se aparea con T y C con G, el apareamiento se mantiene debido a la acción de los puentes hidrogeno entre ambas bases). Tome nota que una purina con doble anillo siempre se aparea con una pirimidina con un solo anillo en su molécula. Las purinas son la Adenina (A) y la Guanina (G). Durante este curso hablamos del Adenosin trifosfato (ATP), pero en ese caso el azúcar era la ribosa, mientras que en el ADN se encuentra la desoxirribosa.Las Pirimidinas son la Citosina (C) y la Timina (T). Imagen de G. S. Stent, Molecular Biology of Bacterial Viruses. Copyright © 1963 by W. H. Freeman and Company Las bases son complementarias, con A en un lado de la molécula únicamente encontramos T del otro lado, lo mismo ocurre con G y C. Si conocemos la secuencia de bases de una de las hebras, conocemos su complementaria. La imagen superior fue Modificada de: http://www.whfreeman.com/life/update/. Note que mientras una hebra va de 3' a 5' la otra lo hace de 5' a 3' (antiparalelas) En cada extremo de una doble hélice lineal de DNA, el extremo 3'-OH de una de las hebras es adyacente al extremo 5'-P (fosfato) de la otra. En otras palabras, las dos hebras son antiparalelas, es decir, tienen una orientación diferente. En el esqueleto azucar -fosfato de del ADN los grupos fosfato se conectan al carbono 3´ de la molécula de desoxirribosa y al carbono 5´ de la siguiente, uniendo azúcares sucesivos. La prima (´) indica la posición del carbono en un azúcar. Por convención, la secuencia de bases de una hebra sencilla se escribe con el extremo 5'-P a la izquierda. Enlaces Estructura del ADN - Traducción del trabajo original de Watson y Crick; http://www.bioxeo.com/adn.htm Estructura del ADN; http://enzimas.gq.nu/ADN.htm Landmarks In the History of Geneticshttp://cogweb.english.ucsb.edu/EP/DNA_history.html The DNA Learning Center (Cold Spring Harbor Laboratory) This site has several excellent animations (Shockwave enhanced) as well as information about their favorite molecule, DNA. http://darwin.cshl.org/ Access Excellence (Genentech) A resource with graphics and other materials to augment molecular genetics. http://www.gene.com/ae/ Primer on Molecular Genetics (Department of Energy) http://www.gdb.org/Dan/DOE/intro.html Tutorial on EUKARYOTIC DNA TRANSCRIPTION (UC Davis) http://ocsbcm01.ucdavis.edu/spep-95/dna_rna/home.htm Glossary (DOE) Terms peculiar to molecular genetics. Importante glosario en inglés. http://www.gdb.org/Dan/DOE/prim6.html Gene Zine A very good beginning on how genes work. http://www.geocities.com/CapeCanaveral/Lab/5451/index.htm The Genome Database (Johns Hopkins University) Search databases for a specific gene http://gdbwww.gdb.org/gdb/gdbtop.html Genome Machine (University of Washington) A clickable map connecting to the GDB (above). http://www.pathology.washington.edu/GDB_select_chromosome_old.html